糞便樣品的保存與運輸

MOBIO最近新發布了產品，PowerMicrobiome RNA Kit 和PowerMag Microbiome RNA/DNA Isolation Kit，隨之而來有非常多關于糞便DNA和RNA提取方面的咨詢。其中最常問到的是，糞便樣品在進一步處理前應如何儲藏運輸。

我詢問了人類糞便/腸內容物方面的專家Dr. Rob Knight。Dr. Knight的實驗室在American Gut Project中扮演了重要角色，它接收著來自美國各地寄來的糞便樣品。

Rob談及他在2010年發布的一篇文章，關于不同溫度條件下儲存的糞便樣品微生物群落的結構和變化（1）。他的實驗表明，在長達兩周室溫下保存的糞便樣品中的微生物群落結構保持完好，只有極小的變化。因此，室溫或使用普通冰袋運輸糞便樣品都是可以的。

從微生態學角度解釋這個現象。不同個體的糞便是由占不同百分比的膽汁、膽紅素、亞鐵血紅素和消化了的食物組成的復雜環境。保護微生物所處原生環境是維持微生物處于靜止狀態的最好方法。加入含高濃度鹽的防腐劑在變性蛋白的同時也會殺死部分微生物（若你經常進食快餐和速凍披薩，那你的微生物可能比較適應防腐劑中添加的鹽）。加入變性化學試劑極大改變所處微生態環境，防腐劑作用下仍能存活下來的微生物，在長時間的保存過程中也會不可避免地發生變化。為保護糞便樣品DNA和RNA所采取的防護措施，必須以細胞不破裂，維持微生物多樣性為前提。

反復凍融對微生物是有害的，解凍過程中冰晶體會促使細胞破裂。所以，避免樣品反復凍融可減少不穩定菌種的損失。對于RNA提取，反復凍融的危害更不用說。

對于RNA

糞便RNA提取呢？需要用到一些特殊的技巧。 我們在實驗室提取糞便RNA過程中發現了這樣一些問題。第一，糞便中充滿死細胞，宿主的和微生物的。大量降解的RNA在電泳或生物分析儀中對提取的RNA造成嚴重的背景干擾。若RNA離心柱綁定吸附過程中使用的乙醇由原來的100%換用70%，離心柱回收過程可以除去低分子量的RNA。當然，如果你對microRNAs也感興趣，這個步驟還是可以繼續使用100%酒精。

另一個重要因素是影響糞便容積和重量的糞便中未消化食物的數量和種類，直接減少實際進入處理的微生物細胞數量。我們有客戶已經研發出了RNA提取前去除糞便樣品中未消食物的方法，可大大提高回收的完整RNA得率。如果你感興趣，請聯系我們。

最后，提取過程中盡快加入穩定劑是獲得高質量RNA的關鍵。有兩種穩定劑你可加入到裂解緩沖液中。一是最常用的β巰基乙醇（BME）。β巰基乙醇是種強力還原劑，RNase有二硫鍵。還原劑破壞酶的空間結構致使滅活。BME可不可逆地破壞RNase，但其難聞的氣味著實令人難受，不過至少可以拒推銷人員于門外，免得他們打擾你的實驗……

另一個選擇是加入酚氯仿pH7-8（PCI）。只要加入100μl就可滅活核酸酶，起穩定作用。加樣前先把穩定劑加入到裂解緩沖液中，樣品可快速得到保護，避免進一步降解。尤其是剛從冰箱中取出的樣品。若要給整塊96孔板加糞便樣品，處理時間至少一個小時，快速加入保護劑尤其重要。

對于已經加入RNALater作為保護劑的糞便樣品，經過我們RNA和DNA提取的測試證明，它是有效的。但這類樣品加樣量要控制在100mg。RNALater中的鹽與糞便成分相互作用形成沉淀。加入太多樣品容易造成硅膠濾膜堵塞，大大影響回收率。

這是目前我們對糞便樣品的了解，感謝與我們一起參與此計劃的眾多合作者。隨著我們對這種獨特而重要樣品認知的增加，相信會有更多糞便研究技術會被開發出來。若你有任何建議或問題，請隨時與我們聯系！

• 1. Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples. FEMS Microbiol Lett. 2010 June; 307(1): 80–86. Christian L. Lauber, Nicholas Zhou, Jeffrey I. Gordon, Rob Knight, Noah Fierer